С.В. Минаев, В.С. Обозин, Г.М. Барнаш, А.Н. Обедин
Ставропольская государственная медицинская академия (СтГМА), кафедра детской хирургии, г. Ставрополь, РФ
Влияние энзимов на формирование послеоперационных спаек в брюшной области
Сергей Викторович Минаев / e-mail: sminaev@yandex.ru Ключевые слова: спаечный процесс, VEGF, bFGF, ламинин, профилактика.
Краткий обзор и введение
Спайкообразование остается частой проблемой после абдоминального вмешательства. Однако с появлением специфических агентов, целенаправленно использующихся против воспалительных процессов и неоангиогенеза, начинает развиваться новый подход к борьбе со спайкообразованием.
Методы: 70 взрослых крыс были разделены на две группы: энзимную (35 крыс) и контрольную (35 крыс). После этого была проведена лапаротомия с десерозированием слепой кишки и париетальной брюшины. В энзимной группе применялся препарат Вобэнзим (комбинация высокоактивных ферментов растительного и животного происхождения + рутозид), растворенный в 2 мл стерильного физиологического раствора, который вводился через желудочный зонд в течение 21 дня. Животным из контрольной группы вводился только физиологический раствор без ферментов. В первый, третий, седьмой и двадцать первый послеоперационные дни животные выводились из исследования по восемь крыс из каждой группы. Проводилось определение VEGF, bFGF и ламинина в висцеральной и париетальной брюшине животных при иммуногистохимическом (ИГХ) анализе.
Результаты: Средний уровень спай-кообразования в энзимной группе был существенно ниже, чем в контрольной группе. Сравнение двух групп показало, что экспрессия VEGFa ,bFGFа и ламинина в энзимной группе ниже, чем в контрольной группе. Более того, что в энзимной группе концентрация bFGFа и ламинина достигла пика на седьмой день, тогда как в контрольной группе это произошло в 21ый день.
Выводы: Наше исследование установило, что проводимая полиэнзимная терапия после созданного спаечного процесса в брюшной полости уменьшает выраженность послеоперационных фиброзных сращений. Данный благоприятный эффект объясняется более низким уровнем ангиогенных агентов (VEGF, bFGF) и ламинина после приема гидролитических энзимов.
Введение
Спайкообразование в брюшной полости является главной причиной, приводящей к инвалидности и летальным исходам в абдоминальной хирургии. Патогенез развития спаечного процесса является многосторонним и недостаточно изученным. Любая операция на органах брюшной полости сопровождается выпадением фибрина. Последние могут привести к развитию спаечной болезни (СБ), которая является главной причиной кишечной непроходимости (КН). Несмотря на прогресс в лечении СБ, доля осложнений, в том числе и развитие КН, все еще остается достаточно высокой. На сегодняшний день ангиогенные агенты, такие как VEGF, bFGF и ламинин, в абдоминальной хирургии изучены мало. Вместе с тем исследования ангиогенеза в процессе спайкообразования очень важны для целенаправленной профилактики и лечения спаечной непроходимости.
В медицине гидролитические энзимы, принимаемые внутрь, используются в лечении различных заболеваний и патологических состояний. Использование комбинации энзимов показало более высокий результат, чем применение моноферментных форм. Энзимные препараты хорошо переносятся и безопасны. Системная энзимотерапия представляет собой терапевтический подход, состоящий из перорального приема высоких доз гидролитических животных и растительных энзимов. Цель нашего исследования — изучение роли ангио-генных факторов в брюшном фиброзе и влияние протеолитических энзимов на ангиогенез спаечного процесса в брюшной полости.
Материалы и методы
Эксперимент был поставлен на 70 взрослых крысах с массой тела 150-180 г. Животные были разделены на две группы: энзимную (32 крысы) и контрольную (32 крысы). Шесть животных составили группу сравнения. Моделирование спаечного процесса в брюшной полости проводили путем выполнения срединной лапаротомии с десерозиро-ванием стенки толстой кишки и брюшины передней брюшной стенки этиловым спиртом. В энзимной группе крысам был прописан через желудочный зонд препарат Вобэнзим (комбинация животных и растительных протеолических ферментов: Панкреатин 345 P.E.P.-U (100 мг), Трипсин 360 F.I.P-U (24 мг), Химотрип-син 300 F.I.P-U (1 мг), Амилаза 50 F.I.P-U (10 мг), Липаза 34 F.I.P-U (10 мг), Папаин 90 F.I.P-U (60 мг), Бромелаин 225 F.I.P-U (45 мг), Рутин (50 мг)), растворенный в 2 мл стерильного физиологического раствора. В течение 21 дня крысам энзимной группы вводилась через желудочный зонд полиэнзимная смесь в дозе 100 мг/кг в день. Контрольная группа получала через желудочный зонд то же количество физиологического раствора без ферментов два раза в день. В первый, третий, седьмой и двадцать первый послеоперационные дни выводились из исследования по восемь крыс из каждой группы для проведения исследования. Исследована брюшная полость животных с подсчетом спаек и определением степени спайкообразования с использованием методики Р.А. Женчевско-го двумя исследователями, которым была неизвестна принадлежность крыс к какой-либо из групп. Проводилось определение VEGF, bFGF и ламинина в висцеральной и париетальной брюшине животных с помощью ИГХ анализа. Использовали моноклональные антитела к белку базальной мембраны — Ла-минину (Laminin γ1, R&D Systems, Inc.), к факторам ангиогенеза: к васкулоэн-дотелиальному фактору (VEGF, R&D Systems, Inc.) и к основному фактору роста фибробластов (bFGF, R&D Systems, Inc.). Рабочая концентрация антител составляла 5-8 μг/мл для исследуемых тканей с толщиной нарезки 5-15 μм. Клетки сосудистых эндотелиальных клеточных мембран и/или их цитоплазмы, в которых присутствовали VEGF и bFGF, окрашивались в желто-коричневый цвет. Было исследовано не менее 5 полей зрения в случайном порядке под световым микроскопом на увеличении х400, число клеток, накапливающих фактор ангиогенеза, подсчитывали в 500 эндотелиоцитах. Регистрация результата проводилась согласно количественному соотношению клеток, накапливающих маркер, и критерию, сформулированному на Пекинской конференции по стандартизации ИГХ методов диагностики: 0-25%: VEGF и bFGF отрицательный (-); 26-50%: слабо положительный (+); 51-75%: умеренно положительный (++); 76-100%: резко положительный результат (+++).
Рисунок 1.
Микрофото на 3-й сутки эксперимента (окраска — гематоксилин и эозин, х80): В контрольной группе сохранились отек и сосудистая гиперемия, кровоизлияние, диффузная инфильтрация серозной оболочки полиморф-ноядерными лейкоцитами.
Ламинин исследовался с помощью определения моноклональных антикрысиных γ 1 антител к Ламинину. Интерпретация результатов окраски: резко положительный результат (+++) — Ламинин в виде выраженной темно-коричневой жирной линии по базальной мембране капилляра; умеренно положительный результат (++) — выраженная коричневая прерывистая жирная линия по базальной мембране капилляра; слабо положительный результат (+) — Ламинин в виде поверхностного фрагмента коричневого окрашивания по базальной мембране капилляра и отрицательный результат (-) — отсутствие Ламинина.
Все статистические анализы были проведены с использованием программного обеспечения Biostatistics, версия 4.03 (McGraw Hill, USA). Данные были выражены в виде среднего значения со стандартным отклонением. Оценка выраженности спаечного процесса и тканевого повреждения осуществлялось критериями Краскела — Уоллиса и теста Хи-квадрат.
Результаты
Контрольная группа показала более высокий процент слепокишечных спаек, чем энзимная группа (тест хи-квадрат=23.1, df=2, p=0.001). Процентное содержание животных без спаечного процесса составило 20% в контрольной группе и 60% — в энзимной группе.
В обеих группах животных в 1-й и 3-й дни эксперимента мы выявили на большой части висцеральной брюшины отмечали десквамацию и разрушение эпителиальных клеток в обеих группах животных. Подлежащая соединительнотканная строма была отечна и разрыхлена с выраженными сосудистыми нарушениями (гиперемия сосудов, стазы, тромбоз и кровоизлияния). В контрольной группе сохранялся отек и гиперемия сосудов, кровоизлияние, диффузная инфильтрация серозной оболочки полиморфноядерными лейкоцитами. В энзимной группе степень отека в соединительной ткани была ниже, но сосудистые нарушения сохранились.
К 7-м суткам оставались повреждения на периетальной брюшины в обеих группах животных. Визуализировалась тонкая полоска фибрина. Однако большая часть фибрина в энзимной группе была лизирована, особенно вдоль краев поражения. Также отмечалась пролиферация мезотелия. В контрольной группе отек брюшины уменьшился и снизилась выраженность сосудистой реакции. Стенка кишечника была инфильтро-вана нейтрофильными лейкоцитами, имелась эозинофильная инфильтрация. В энзимной группе было зафиксировано растворение микротромбов, рассасывание кровоизлияний и исчезновение стаза. Отмечались случаи периваскулярной лимфоцитарной инфильтрации.
К 21-м суткам определялось полное рассасывание фибрина в контрольной группе, с последующей заменой фибрина грануляционной тканью и образованием спаек между листами висцеральной брюшины. Образованные спайки были богаты клеточными элементами (фибро-бластами, гистиоцитами, лимфоцитами, плазмоцитами, а также многоядерными гигантскими клетками). В энзимной группе спайки состояли из грануляционной ткани, где вдобавок к новообразованным сосудам и клеточным элементам наблюдались пучки новых коллагеновых волокон. В грануляционной ткани воспалительных процессов не было. Местами в брюшине, в основном периваскулярно, присутствовала лимфоплазматическая инфильтрация.
Наше исследование установило снижение спаечного процесса в энзимной группе. Сравнение двух групп показало, что экспрессия VEGF, bFGF и ламинина в энзимной группе была ниже, чем в контрольной группе. В энзимной группе концентрации bFGF и ламинина были самыми высокими к 7-м суткам эксперимента, в то время как в контрольной группе максимальная концентрация наблюдалась к 21-м суткам.
Обсуждение
Факторы роста, такие как VEGF и bFGF, могут вызвать и ускорить образование кровяных капилляров. VEGF известен как самый важный фактор, напрямую влияющий на рост кровеносных сосудов, и его экспрессия тесно связана с плотностью капиллярной сети и количеством новых сосудов.
Подобным образом обладает bFGF, который считается фактором, стимулирующим пролиферацию клеток ме-зодермального и нейроэктодермального происхождения, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, нейробласты и кератиноциты. bFGF — хемотаксиче-ский и митогенный фактор роста для эндотелиальных клеток в лабораторных условиях, вызывающий эндотелиально-клеточное производство факторов, участвующих в разрушении базальной мембраны и перемещении капиллярных эндотелиальных клеток в коллагенсодержащий матрикс для последующего образования капилляроподобных структур. Эти и другие наблюдения в лабораторных условиях показывают, что FGF в естественных условиях играет роль в модуляции таких процессов, как ангиогенез, заживление ран и восстановление тканей, включая спаечный процесс в брюшной полости.
Ангиогенез является неотъемлемым этапом при формировании спаек. Патологический ангиогенез происходит тогда, когда эффект стимулирующих молекул превосходит эффект ингиби-рующих. Проведенные исследования показали, что ангиогенез подразумевает больше чем простую пролиферацию эндотелиальных клеток. Эндотелиоци-ты делятся и внедряются в базальную мембрану, а затем подвергаются диффе-ренцировке и участвуют в формировании капилляров. Этот процесс контролируется ангиогенными молекулами, а также другими факторами, такими как распавшиеся ферменты, которые опосредуют вышеуказанный процесс. Прием смеси ферментов, содержащей броме-лаин, трипсин, химотрипсин и папаин, стимулирует клеточную экспрессию факторов роста, VEGF, bFGF, PDGF-BB и TIMP-1. Известно, что добавление протеаз стимулирует цитотоксичность периферических нейтрофилов in vitro. Проведенное исследование показало [3], что полиферментный препарат Вобэн-зим увеличивает уровень ингибитора ангиогенеза (TIMP-1) и снижает уровень стимуляторов ангиогенеза в крови (VEGF и bFGF).
Экстраклеточный матрикс (ЭКМ) — это вещество, окружающее нижний слой соединительной ткани эпителиальных или эндотелиальных клеток. ЭКМ является одним из важных условий для васкуляризации. В нашем исследовании ламинин был главным показателем ЭКМ, который ярко экпрессировался у всех крыс в контрольной группе. Целостность брюшного мезотелия — самый важный элемент для физиологического предотвращения спайкообразования. Брюшной мезотелий ответственен за появление фактора активации плазминогена, который содействует лизису фибрина, и этот процесс лизиса наиболее активен в первые 3-4 дня после образования фибрина в очаге воспаления. Применение Вобэнзима в данный период привело к снижению развития мезотелиальных спаек в энзимной группе по сравнению с результатами в контрольной группе.
Другие исследования также показали, что бромелаин или энзимные смеси замедляют воспалительные реакции у эндотоксических мышей, в основном снижением γ-интерферона в Пейеро-вых бляшках и селезенке. Изменения в соотношении функций Thl/Th2 после системной энзимной терапии были также продемонстрированы Engwerda с соавт., которые установили, что бромелаин и трипсин улучшают реакцию Т-зависимых антител в естественных условиях и обеспечивают переход к Тп2-подобному цитокиновому профилю в лабораторных условиях. Для того чтобы узнать, может ли усиление реакции рецептора IL-4 и IL-10 в нормальных условиях снизить цитокиновую реакцию после операции, необходимы дальнейшие исследования.
При эндотоксемии прием гидролитических энзимов (трипсин, бромелаин, химотрипсин, амилаз, липаз и папаина) не только снижал показатели количества лимфоцита, но также приводил к специфическому снижению количества CD4+ клеток в воспалительных тканях. Это представляет особый интерес, потому что считается, что CD4+ клетки способствуют развитию воспалительных процессов и поддерживают их. Общепринято, что воспалительное поражение при рассеянном склерозе, язвенно-некротическом колите и ревматоидном артрите происходит благодаря этим клеткам. Протеазы, содержащиеся в Вобэнзиме, обладают противовоспалительным эффектом.
Наше исследование показало, что системная энзимная терапия снижает число случаев воспалительных процессов при оперативных вмешательствах, таким образом препятствуя образованию послеоперационных спаек у крыс. Сочетание животных и растительных протеаз способствует адекватному биологическому ответу.
Известно, что бромелаин, папаин и амилаза способствуют выработке ци-токинов в лабораторных условиях в периферийных мононуклеарных клетках. Прием энзимных смесей, содержащих в своем составе бромелаин, трипсин, химотрипсин и папаин, способствует экспрессии фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а), интерлейкина-1β и интерлейкина-6 мононуклеарными клетками заново при инкубировании в условиях ex vivo с гамма-интер-феронами. Также было установлено, что протеазы вызывают респираторный взрыв в гранулоцитах с сопутствующим появлением активных форм кислорода. Известно, что добавление протеаз способствует усилению цитотоксичности в периферийных нейтрофилах в лабораторных условиях. В исследованиях, проведенных в условиях in vitro и in vivo, трипсин способствовал гидроли-зированию «спаечных» молекул CD44, CD4 и B7 активированных Т-клетками и макрофагами. Бромелаин и папаин в полиферментном препарате также гидролизуют CD44 и способствуют улучшению реакции на трипсин. Как следствие этих эффектов, происходила активация Т-лимфоцитов и макрофагов, которые способствовали снижению воспалительных реакций.
Выводы
Наше исследование установило, что проводимая полиэнзимная терапия после созданного спаечного процесса в брюшной полости уменьшает выраженность послеоперационных фиброзных сращений. Данный благоприятный эффект связан со снижением уровня ангиогенных факторов (VEGF, bFGF) и ламимина на фоне пероральной полиэнзимной терапии.
Благодарность
Авторы выражают благодарность профессору Эндрю Б. Пинтеру за помощь в подготовке рукописи.
Финансирование: Исследование финансировалось грантом Президента РФ МД-84.2008.7
За дополнительной информацией обращаться:
тел: (+998 90) 370-37-73
mucos.uz@inbox.ru
www.wobenzym.uz